Ottmar Distl

Institut für Tierzucht und Vererbungsforschung der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, Bünteweg 17p, 30559 Hannover

Einleitung

Es gibt mehrere Möglichkeiten Taubheit zu klassifizieren. Je nach den betroffenen Strukturen des Gehörorgans lassen sich konduktive und sensorineurale Formen unterscheiden. Erstere entstehen durch Störungen des Konduktionsmechanismus im äußeren Gehörgang und im Mittelohr. Ursachen für konduktive Hörstörungen können zum Beispiel chronische Otitis externa oder media, Frakturen von Mittelohranteilen oder Tumoren sein. Sehr viel öfter tritt die sensorineurale Taubheit auf, bei der Hörverlust als Folge von Transduktions- und Transmissionsstörungen in der Cochlea (Schnecke) sowie in peripheren und zentralen Anteilen des Nervus cochlearis entsteht. Der Hörverlust kann bereits seit der Geburt bestehen (kongenital) oder er kann erst im Laufe der weiteren Lebenszeit auftreten.
Beim Menschen ist mehr als die Hälfte der Fälle von kongenitaler Taubheit erblich bedingt. Die kongenitale ererbte Taubheit kann als Teil einer multisystemischen Krankheit (syndromisch) oder als eine auf das Ohr und das vestibuläre System begrenzte Funktionsstörung (nicht-syndromisch) auftreten. Da die nicht-syndromische erbliche Taubheit fast ausschließlich durch Cochleadefekte verursacht wird, leiden die Patienten unter sensorineuraler Taubheit. Es wird geschätzt, dass die nicht-syndromische erbliche Taubheit 60-70% aller menschlichen Taubheitsfälle verursacht (Morton, 1991). Weiterhin sind 70-80% der Fälle der nicht-syndromischen Taubheit beim Menschen auf einen autosomal rezessiven Erbgang zurückzuführen, gefolgt von einem autosomal dominanten Erbgang mit 10-20% der Fälle und 1-2% der Fälle sind X-gekoppelt. Ein noch geringerer Prozentsatz wird durch einen maternalen Erbgang verursacht (Van Camp und Smith, 2006).
Ca. 1% der etwa 30.000 menschlichen Gene sind nach Schätzungen wichtig für den Hörprozess (Friedmann und Griffith, 2003). Annähernd 120 Gene sind inzwischen identifiziert, die für verschiedene Formen der menschlichen vererbten Taubheit verantwortlich sind. Darunter sind ungefähr 80 Gene für die syndromische und 39 Gene für die nicht-syndromische vererbte Taubheit verantwortlich (The Hereditary Hearing Loss Hompage: http://webhost.ua.ac.be/hhh/).
Die kongenitale sensorineurale Taubheit ist eine Erkrankung, von der viele Säugetierspezies betroffen sind. Beim Hund werden über 54 verschiedene Rassen beschrieben, bei welchen ein kongenitaler Hörverlust gehäuft auftritt (Strain 1996 und 2004). In zahlreichen europäischen und amerikanischen Studien weisen hierbei die Dalmatiner mit 16,5-29,9% die höchste Taubheitsinzidenz auf (Famula et al., 1996; Wood und Lakhani, 1997; Muhle et al., 2002; Juraschko et al., 2003a; Rak und Distl, 2005).
Die histologischen Veränderungen im Innenohr bei Hunden mit Hörverlust werden im Allgemeinen ähnlich wie beim Menschen als cochleosacculär beschrieben (Johnsson et al., 1973). Die Degenerationen im Innenohr schreiten bei betroffenen Tieren mit zunehmendem Alter fort und führen normalerweise in einem Alter von drei bis vier Wochen, spätestens aber in einem Alter von etwa vier Monaten zu einem vollständigen, ein- oder beidseitigen Hörverlust (Strain 1996).
Eine objektive Diagnose der Taubheit, besonders wenn sie nur einseitig ist, stützt sich auf die "brainstem auditory evoked response" (BAER, AEP), ein elektro-diagnostischer Test, bei dem elektrische Aktivitäten in der Cochlea und den Nervenbahnen zur auditorischen Hirnrinde nach akustischen Signalen in einer bestimmten Lautstärke detektiert werden.
Obwohl für den Dalmatiner die Erblichkeit der Erkrankung wiederholt nachgewiesen werden konnte (Famula et al., 2000; Muhle et al., 2002; Juraschko et al., 2003b), wurden für die verschiedenen untersuchten Dalmatinerpopulationen unterschiedliche Erbgänge in Betracht gezogen. Es ist bisher nicht gelungen, die genaue Anzahl der beteiligten Gene zu bestimmen. Auch war es bislang für keine der betroffenen Hunderassen möglich, ein taubheitsverursachendes Gen zu identifizieren.
Das Züchten mit ein- oder beidseitig nicht-hörenden Dalmatinern sowie Dalmatinern mit blauen Augen ist in Deutschland verboten und es wird von den Zuchtverbänden vorgeschrieben, dass alle Dalmatinerwelpen in einem Alter von etwa 6 bis 8 Wochen audiometrisch mittels AEP untersucht werden. Des Weiteren ist der Defekt tierschutzrelevant nach § 11b des Deutschen Tierschutzgesetzes, da der artgemäße Gebrauch eines Organs eingeschränkt wird und eine Erblichkeit nachgewiesen wurde. Somit dürfen ein- oder beidseitig nicht-hörende Tiere nicht zur Zucht verwendet werden.
Es hat sich gezeigt, dass allein der Zuchtausschluss betroffener Tiere nicht genügt, um die Taubheitsinzidenz beim Dalmatiner deutlich zu reduzieren. Aus diesen Gründen ist es von erheblicher Bedeutung, die kongenitale sensorineurale Taubheit beim Dalmatiner molekulargenetisch zu untersuchen, um so ein molekulargenetisches Testverfahren entwickeln zu können, welches auch die Identifizierung von Anlageträgern ermöglicht.

Material und Methoden

Für 24 Kandidatengene wurde ein Mikrosatelliten Marker Set entwickelt (Rak und Distl, 2005; Rak et al., 2002a, 2002b, 2002c, 2003; Drögemüller et al., 2002; Kuiper et al., 2002). Das Marker Set beinhaltete Mikrosatelliten für folgende Kandidatengene: CDH23, CLDN14, COCH, COL11A2, DFNA5, DIAPH1, EDN3, EDNRB, EYA4, GJA1, GJB2, GJB6, MITF, MYH9, MYO6, MYO7A, MYO15A, OTOF, PAX3, POU4F3, SLC26A4, SOX10, TECTA und TMPRSS3. Als Familienmaterial für die Mikrosatellitenstudie wurden 215 Dalmatiner verwendet. Die Tiere verteilten sich auf 24 wenig miteinander verwandte Dalmatinerfamilien. Die genotypisierten Familien bestanden aus sämtlichen ein- oder beidseitig nicht hörenden Nachkommen (uni- oder bilateral nicht hörend), ihren Eltern und einem bis vier nicht betroffenen Voll- oder Halbgeschwistern. Mindestens zwei der Vollgeschwister einer Familie waren uni- oder bilateral nicht hörend. Der Phänotyp der verwendeten Tiere wurde durch einen AEP-Test bestimmt.
Alle Mikrosatelliten Marker wurden über PCR und Polyacrylamidgelelektrophorese dargestellt und mittels nicht-parametrischer Kopplungsanalyse ausgewertet.
Für weitere acht Kandidatengene (TMC1, TMIE, USH1C, MYH14, MYO3A, PRES, WHRN und ESPN) wurden intragenische Single Nucleotide Polymorphism (SNP) Marker entwickelt und wiederum Kopplungs- und Assoziationsstudien zugeführt (SNP =Basenaustauch, der eine einzelne Base in der DNA Sequenz betrifft). Als Familienmaterial für die Genotypisierung der SNPs in den oben erwähnten acht neuen Kandidatengenen wurde DNA von insgesamt 39 Dalmatinern verwendet, die vier Familien angehörten. Mindestens zwei der Vollgeschwister einer Familie waren uni- oder bilateral nicht-hörend. Die vier Familien bestanden aus sechs bis zehn Vollgeschwistern und den dazugehörigen Elterntieren.
Mithilfe der kandidatengen-assoziierten Marker war es über eine Kopplungsanalyse an 24 Dalmatinerfamilien möglich, aus der Gruppe der insgesamt 32 Kandidatengene die wichtigsten Gene für die kongenitale sensorineurale Taubheit herauszufiltern. Drei Gene, das MYH9 Gen auf CFA10, das GJA1 Gen auf CFA1 und das CLDN14 Gen auf CFA31, zeigten eine signifikante Kopplung zur caninen Taubheit und wurden im nächsten Projekt weitergehend molekulargenetisch untersucht.
Die Studie zeigte weiterhin, dass in einzelnen Familien unterschiedliche Gene mit der Taubheitsinzidenz gekoppelt waren. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Erbgang der kongenitalen sensorineuralen Taubheit bei Dalmatinern vermutlich wie beim Menschen genetisch heterogen ist. Aufgrund der Heterogenität zwischen den Familien wurden für die Sequenzierung von dem MYH9 Gen, dem GJA1 Gen und dem CLDN14 Gen nur die Familien mit dem höchsten Beitrag zu den Teststatistiken ausgewählt.
Für die Sequenzierung von MYH9 auf dem Hunde-Chromosom 10 (CFA10) wurden 16 Tiere aus drei Dalmatinerfamilien verwendet. Zur Untersuchung von SNPs im CLDN14 Gen auf CFA31 wurden 36 Tiere aus fünf Familien und 12 Tiere aus einer Halbgeschwisterfamilie verwendet. Für die Suche nach Polymorphismen im GJA1 Gen auf CFA1 wurden 16 Tiere aus einer Halbgeschwisterfamilie verwendet.
Anschließend wurden insgesamt 60 Mikrosatelliten Marker, auf den caninen Chromosomen 1, 10 und 31 evaluiert. Mit jeweils 27 Mikrosatelliten wurde CFA1 und mit 27 Mikrosatelliten wurde CFA10 vollständig abgedeckt. Insgesamt 6 Marker wurden für CFA31 verwendet. Diese chromosomenweiten Kopplungsanalysen dienten dazu, um die Ergebnisse aus den Sequenzanalysen abzusichern und um abzuklären, ob noch weitere Genomregionen auf den jeweiligen Chromosomen mit der kongenitalen sensorineuralen Taubheit gekoppelt sind. Für die Mikrosatellitenstudie auf den caninen Chromosomen 1, 10 und 31 wurden insgesamt 176 Dalmatiner einbezogen. Die Tiere verteilten sich auf 23 wenig verwandte Dalmatinerfamilien. Die Familien bestanden aus sämtlichen Nachkommen mit unilateralem oder bilateralem Hörverlust, ihren Eltern und einem bis vier nicht betroffenen Voll- oder Halbgeschwistern. Mindestens zwei der Vollgeschwister einer Familie waren unilateral oder bilateral nicht hörend. Auch hier wurde der Phänotyp der verwendeten Tiere durch einen AEP-Test bestimmt. Diese 176 Dalmatiner stammten aus anderen Familien als die 24 Dalmatinerfamilien, die zu Beginn des Forschungsprojekts verwendet wurden. Für die Feinkartierung auf CFA10 mit Hilfe von SNPs wurden dagegen nur noch 34 Tiere aus fünf Dalmatinerfamilien verwendet, die eine eindeutige Kopplung zur kongenitalen sensorineuralen Taubheit in der entsprechenden genomischen Region zeigten.

Ergebnisse

Für acht neue Kandidatengene (TMC1, TMIE, USH1C, MYH14, MYO3A, PRES, WHRN und ESPN) wurden mindestens zwei heterozygote SNPs entwickelt. Die nicht-parametrische Kopplungs- und Assoziationsanalysen zeigten keine signifikanten Teststatistiken. Offensichtlich war kein Haplotyp mit der caninen kongenitalen sensorineuralen Taubbheit (CCSD) in den untersuchten Familien assoziiert. Da sowohl uni- und bilateral nicht-hörende Tiere als auch beidseitig hörende Tiere über identische Haplotypen verfügten, ist es unwahrscheinlich, dass die Gene TMC1, TMIE, USH1C, MYH14, MYO3A, PRES, WHRN und ESPN an der Entstehung der kongenitalen sensorineuralen Taubheit in den untersuchten Dalmatinerfamilien beteiligt sind (Mieskes und Distl, 2006, 2007a).
Für 24 Kandidatengene stand ein Mikrosatelliten Marker Set aus 43 Markern mit einem bis drei Markern pro Kandidatengen zur Verfügung. Aufgrund der Kopplungsstudie an 24 Familien konnten auf den caninen Chromosomen (CFA) 1, 10 und 31 die Kandidatengene identifiziert werden, die mit der kongenitalen sensorineuralen Taubheit der Dalmatiner im Zusammenhang stehen. Eine signifikante Kopplung mit der kongenitalen sensorineuralen Taubheit wurde für die Gene GJA1 auf CFA1, MYH9 auf CFA10 und CLDN14 auf CFA31 in diesen Dalmatinerfamilien gefunden (Distl et al., 2007). Die Gene GJA1, MYH9 und CLDN14 wurden anschließend einem Vergleich zwischen hörenden und einseitig wie beidseitig nicht-hörenden Dalmatinern unterzogen.

Ergebnisse von CFA1
Mit Hilfe von 27 Mikrosatelliten Markern für CFA1 wurde an 176 Dalmatinern eine nicht-parametrische Kopplungsanalyse durchgeführt. Die Kopplungsanalyse zeigte für alle Familien keine signifikanten Teststatistiken. Allerdings konnte für einzelne Familien eine signifikante Kopplung zwischen den Markern für das GJA1 Gen und CCSD gefunden werden. Eine Kopplung zu Mikrosatelliten distal oder proximal von GJA1 war in diesen Familien nicht feststellbar. In einer Halbgeschwisterfamilie mit 16 Tieren wurde eine signifikante Kopplung zu GJA1-assoziierten Markern festgestellt. Mit Hilfe der DNA von Tieren aus dieser Halbgeschwisterfamilie wurde daraufhin eine Sequenzanalyse des GJA1 Gens durchgeführt. Es wurden 3 SNPs im 3´-untranslatierten Bereich gefunden. Allerdings war nur eine Teilfamilie mit 4 Nachkommen (2 hörende und 2 betroffene) informativ. Jedoch zeigten die identifizierten Genotypen keine Assoziation mit dem CCSD Phänotyp. Sowohl die zwei uni- oder bilateral nicht-hörenden und die zwei beidseits hörenden Dalmatiner wiesen identische mütterliche Haplotypen auf. Daher waren in der untersuchten Dalmatinerfamilie die gefundenen Polymorphismen nicht mit CCSD assoziiert. Eine funktionelle Mutation in der kodierenden Sequenz von GJA1 wurde bei diesen Tieren nicht gefunden. Es ist daher möglich, dass Mutationen in nicht-kodierenden Bereichen des GJA1 Gens die Entwicklung der CCSD in der untersuchten Halbgeschwisterfamilie verursachen oder ein Gen in unmittelbarer Nachbarschaft von GJA1 an der Entstehung der sensorineuralen Taubheit beteiligt ist.

Ergebnisse von CFA10
Alle kodierenden 41 Exons mit ihren flankierenden intronischen Sequenzen des MYH9 Gens konnten von 16 Dalmatinern amplifiziert werden. Die Sequenzen wurden mit den entsprechenden Sequenzen vom Boxer aus der NCBI Genbank (Dog Genome Assembly 2.1) verglichen. Die Suche nach Sequenzvariationen im MYH9 Gen ergab 22 SNPs, wobei die meisten Polymorphismen in den flankierenden Regionen der Exons gefunden wurden. Keiner der beobachteten Polymorphismen in den Exons änderte die Aminosäuresequenz von MYH9. Jedoch zeigten die identifizierten Haplotypen keine Assoziation mit dem CCSD Phänotyp (Mieskes und Distl, 2007b).
Im nächsten Arbeitschritt wurden insgesamt 27 Mikrosatelliten Marker auf CFA10 an 176 Dalmatinern aus 23 Familien genotypisiert. Mit Hilfe einer nicht-parametrischen Kopplungsanalyse wurde eine 12 Mb umfassende genomische Region in der Umgebung des MYH9 Gens mit einer signifikanten Kopplung zur CCSD identifiziert.
In dieser 12 Mb umfassenden Genomregion befinden sich beim Hund etwa 80 annotierte Gene. Zur Feinkartierung dieses Bereiches wurde in 60 Genen nach SNPs gesucht. Insgesamt konnten 53 neue SNPs in 27 verschiedenen Genen gefunden werden. Für die Kopplungs- und Assoziationsanalyse einschließlich der SNPs wurden fünf Familien mit 34 Dalmatinern ausgewählt, die eine signifikante Kopplung zur CCSD zeigten. Die SNPs waren größtenteils informativ im vorliegenden Familienmaterial und bestätigten in einer folgenden Assoziationsstudie die Lokalisation auf CFA10 deutlich. Weiterhin konnte die gekoppelte Region auf einen Bereich von 3,5 Mb eingegrenzt werden. Inzwischen konnte ein SNP mit einer signifikanten Assoziation zu CCSD gefunden werden. Somit konnte für diese CCSD Region nachgewiesen werden, dass sie ein Gen beinhaltet, welches auf die Entstehung der caninen kongenitalen Taubheit einwirkt. Zur weiteren Aufklärung ist es notwendig, das mit CCSD assoziierte Gen zu sequenzieren und einer Mutationsanalyse zu unterziehen.

Ergebnisse von CFA31
Auf CFA31 wurde eine Kopplung eines CLDN14-assoziierten Markers mit der sensorineuralen Taubheit beim Dalmatiner festgestellt. Daraufhin wurden acht SNPs entwickelt, indem das einzige beim Menschen translatierte Exon, intronische Sequenzen, sowie 5’- and 3’-untranslatierte Bereiche des CLDN14 Gens einer Sequenzanalyse unterzogen wurden. Nur zwei der identifizierten SNPs waren polymorph in den untersuchten fünf Dalmatinerfamilien. Da sowohl uni- als auch bilateral nicht-hörende und bilateral hörende Dalmatiner identische Genotypen aufwiesen, konnte keine Assoziation festgestellt werden. Da bislang keine funktionelle Mutation in der kodierenden Region von CLDN14 gefunden wurde, ist es für eine eindeutige Aussage über die Rolle des CLDN14 Gens im Entstehungsprozess der kongenitalen sensorineuralen Taubheit beim Dalmatiner notwendig, noch weitere Marker im CLDN14 Gen sowie seiner näheren Umgebung zu entwickeln und zu analysieren. Da keine weitere Kopplung zu Mikrosatelliten distal oder proximal des CLDN14 Gens festgestellt werden konnte, ist es wahrscheinlich, dass entweder das CLDN14 Gen oder ein Gen in seiner unmittelbaren Umgebung an der Entstehung der sensorineuralen Taubheit in den untersuchten Dalmatinerfamilien beteiligt ist.

Fazit

Die Forschungsergebnisse zeigten, dass infolge der genetischen Heterogenität zwischen den Dalmatinerfamilien das Auffinden der für die kongenitale sensorineurale Taubheit ursächlichen Gene erschwert wird. Weiterhin wird deutlich, dass nur wenige der derzeitig identifizierten taubheitsverursachenden Gene beim Menschen eine Rolle bei der Entstehung der caninen Taubheit spielen.
Diese vorliegende Studie kommt in der Entdeckung von taubheitsverursachenden Genen beim Dalmatiner wesentlich weiter, da drei engumgrenzte Genombereiche gefunden werden konnten, die in den untersuchten Dalmatinerfamilien ein ursächlich an der Entstehung der caninen kongenitalen sensorineuralen Taubheit beteiligtes Gen beinhalten. Zur weiteren Aufklärung dieser Gene und zum Auffinden der ursächlichen Mutationen ist es jedoch notwendig, diese Genomregionen noch intensiver mit SNPs zu durchsuchen, um die kausalen Gene zu identifizieren und die für canine kongenitale sensorineurale Taubheit verantwortliche Mutation zu finden. Dafür wird weiterhin die Unterstützung der Dalmatinerzüchter und deren zuchtbuchführender Vereine notwendig sein.

Literatur

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